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血管性痴呆大鼠学习记忆障碍及发病机制

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【摘要】  目的 研究血管性痴呆(VD)大鼠学习记忆障碍及发病机制。方法 4血管阻断法制作模型,Morris水迷宫法检测学习记忆能力,免疫组化法观察Bcl2和Bax表达,流式细胞术检测海马神经细胞凋亡率,亚甲蓝比色法检测血清中H2S含量。结果 模型组大鼠学习记忆能力明显减退。Bcl2/Bax在缺血再灌注(I/R)开始时升高,随后开始下降。模型组大鼠海马神经细胞凋亡率明显增加。模型组大鼠血清中H2S含量明显减少。血清H2S含量与海马神经细胞凋亡率间呈明显负相关。 结论 VD可导致学习记忆障碍,海马神经细胞凋亡和血清中H2S含量减少;海马神经细胞凋亡程度可能与内源性H2S生成减少有关。

【关键词】  血管性痴呆;学习记忆;免疫组化;流式细胞术;硫化氢

血管性痴呆(VD)是老年期痴呆的主要类型之一,它是由一系列脑血管因素(缺血、出血、急慢性缺氧性脑血管病等)导致脑组织损害引起的以认知功能障碍为特征的痴呆综合征〔1〕,不仅给病人带来长期痛苦,严重影响其生活质量,而且给家庭、社会造成沉重负担,因此研究VD的发病机制以指导其防治具有很高的社会价值和现实意义。H2S是第三类气体信号分子,广泛参与机体的多种生理和病理过程,为进一步了解其在VD发病中的作用,本研究观察大脑缺血/再灌注(I/R)不同时间对大鼠学习记忆能力的影响、血清中H2S含量改变及海马CA1区神经细胞凋亡情况,从行为学、细胞凋亡及内源性H2S表达量及其相互关系等方面,探讨VD的发病机制,为其防治提供理论依据。

  1 材料与方法

  1.1 动物与分组 健康Wistar雄性大鼠64只,体重300~350 g(由河北省实验动物中心提供),随机分为8组,正常组,假手术组和VD模型组,VD模型组又分为大脑I/R 2,8,24,72,168和720 h组,每组8只动物。

  1.2 动物模型制备 4血管阻断法(4VO法)〔2〕建立VD大鼠模型。假手术组麻醉及手术过程与VD模型组相同,但不电凝双侧椎动脉,不阻断双侧颈总动脉。术后按再灌注的不同时间分别将动物处死,经主动脉依次灌注生理盐水100 ml和4%多聚甲醛500 ml,取出脑组织,石蜡包埋切片,用于免疫组化显示Bcl2、Bax及苏木素伊红(HE)染色。

  1.3 学习记忆能力的测定 Morris水迷宫检测〔3〕:实验开始于VD术后4 w,预先将迷宫任意分为4个象限。平台放入上述4个象限中随机选择的1个象限中,在大鼠游泳池边标记4点作为大鼠的入水点,记录120 s内大鼠从入水到爬上平台所需的时间,即逃避潜伏期。记录各组大鼠的逃避潜伏期,作为学习记忆能力检测指标。

  1.4 取材 大鼠10%水合氯醛(3 ml/kg体重)腹腔注射麻醉后,快速开胸暴露心脏,心尖取血4~5 ml,分离血清,用于血清H2S含量测定;然后断头处死,并立即在冰台上开颅,迅速分离大鼠海马,用70%酒精固定,4℃冰箱保存过夜,用于流式细胞术检测。

  1.5 HE染色 切片常规脱蜡至水→1%盐酸酒精分化→伊红染色2 min→切片常规梯度酒精脱水→二甲苯Ⅰ→二甲苯Ⅱ→中性树胶封固。

  1.6 免疫组化染色(SP法) Bax兔抗鼠多克隆抗体,Bcl2兔抗鼠多克隆抗体(Santa Cruz公司生产)。

  1.7 流式细胞术检测 采用美国Beckman Coulter公司生产的EpicsXL Ⅱ型流式细胞仪。

  1.8 血清中H2S含量的检测 亚甲蓝分光光度法。

  1.9 统计学处理 用SPSS13.0统计软件,采用单因素方差分析,两两比较采用SNK法。

  2 结 果

  2.1 学习记忆能力检测结果 各组大鼠在迷宫各入水点搜索平台的结果见表1,随着训练天数的增加,各组大鼠的逃避潜伏期均缩短,第2天I/R 720 h组与正常组和假手术组比较逃避潜伏期明显延长(P<0.01);正常组和假手术组逃避潜伏期差异不显著(P>0.05)。

  2.2 VD大鼠病理形态学结果 HE染色后,神经细胞胞浆呈淡红色,核呈蓝黑色。假手术组大鼠海马CA1区神经元排列整齐、密集,细胞完整,结构正常,胞浆丰富,胶质细胞无增生;细胞核呈圆形、椭圆形,无变性,无固缩或溶解现象。VD模型组海马CA1区神经元排列紊乱,神经元变性,体积变小,胞核与胞浆界限不清,核固缩成三角形或不规则形,而且随I/R时间的延长,变性神经元数目越多,见图1。 表1 各组逃避潜伏期比较

  2.3 凋亡蛋白表达结果

  2.3.1 VD大鼠模型海马CA1区Bcl2表达 VD模型组I/R 2 h Bcl2蛋白平均OD值开始明显上调,I/R 8 h达到高峰,之后随I/R时间的延长开始下降,但I/R 24 h组仍高于假手术组。假手术组与I/R不同时间点组间,Bcl2的表达情况均有显著差异(P<0.01)(表2)。

  2.3.2 VD大鼠模型海马CA1区Bax的表达 I/R早期Bax在海马CA1区的表达明显增强,随着再灌注时间的延长,其表达量不断增加,I/R 72~168 h达高峰。假手术组与I/R不同时间点组之间,Bax的表达均有显著差异(P<0.01)(表2)。

2.3.3 Bcl2/Bax比率变化 随I/R时间的延长,Bcl2/Bax的比率逐渐降低(表2)。表2 VD大鼠Bcl2、Bax的表达水平与假手术组比较:1)P<0.05,2)P<0.01

  2.4 流式细胞术检测海马神经细胞凋亡率结果 随着I/R时间的延长,大鼠海马神经细胞凋亡率逐渐增高,其中I/R 2 h组凋亡率最低,I/R 168 h组凋亡率最高。VD模型各时间组与假手术组比较,海马神经细胞凋亡率明显增加(P<0.01);I/R不同时间组间两两比较,各组间海马神经细胞凋亡率均差异显著(P<0.01),见表3。

  2.5 血清H2S含量检测结果 随着I/R时间的延长,大鼠血清H2S含量呈现直线降低趋势,其中IR 2 h组血清H2S含量最高,I/R 168 h组血清H2S含量最低。VD模型各时间组与正常组和假手术组比较,血清H2S含量明显减少(P<0.01);I/R不同时间组间两两比较,血清H2S含量均差异显著(P<0.01);正常组和假手术组血清H2S含量无显著差异(P>0.05),见表3。

  2.6 血清H2S含量与海马神经细胞凋亡率相关分析 随着血清H2S含量的降低,海马神经细胞凋亡率逐渐升高,两者呈现明显的负相关,回归方程为:y=-0.135x+12.068,相关系数r=-0.861(P<0.01),提示内源性H2S可能具有保护神经细胞的功能。表3 各组海马神经细胞凋亡率及血清H2S含量(各组间两两比较:1)P<0.01

  3 讨 论

  目前认为,I/R后神经元死亡的机制是损伤级联反应,脑缺血性损伤级联反应大多以能量衰竭和兴奋性氨基酸毒性开始,以细胞凋亡结束。本实验中用HE染色观察到海马CA1区大量细胞呈现明显的凋亡特征,VD模型组大鼠海马CA1区可见神经元排列紊乱,神经元变性,体积变小,核固缩成三角形或不规则形,胞核与胞浆界限不清。流式细胞术检测海马神经细胞的凋亡率发现VD模型各组与假手术组相比海马神经细胞凋亡率明显增加,而且随着I/R时间的延长,大鼠海马神经细胞的凋亡率逐渐增加。

  在参与调控神经元凋亡的基因和蛋白质产物中,一类是抗凋亡蛋白,包括Bcl2,BclxL,Bclω,Al等;另一类是促凋亡蛋白,包括Bax、Bak、Bad等〔4〕。体外研究显示〔5〕:Bcl2保护细胞免于各种损伤。本实验结果显示VD模型组I/R 2 h后Bcl2蛋白平均光密度值开始明显上调,IR 8 h达到高峰,之后开始下降,但IR 72 h仍高于假手术组;而Bax蛋白在I/R早期在海马CA1区的表达明显增强,且随着再灌注时间的延长,其表达不断增加。Bcl2蛋白家族中促凋亡和抑凋亡两类蛋白的比例即Bcl2/Bax的比率决定细胞在受到凋亡信号刺激后是否发生凋亡〔6〕,本次研究显示Bcl2/Bax的比率随I/R时间的延长逐渐降低,而大鼠海马神经细胞的凋亡率则逐渐增加,这也从另一方面证实了Bcl2蛋白的抗凋亡作用。

  VD主要表现为学习记忆能力的降低,而海马是学习记忆的重要结构,I/R损伤后海马区的神经细胞凋亡势必对学习记忆功能产生重要的影响。本研究利用Morris水迷宫技术对VD模型大鼠的空间学习记忆能力进行测试,发现I/R 720 h组较正常组和假手术组的逃避潜伏期明显延长,表明VD可造成大鼠学习记忆功能障碍,其机制可能是I/R损伤引起海马神经细胞凋亡,从而导致海马学习记忆功能障碍。

  H2S是继一氧化氮(NO)和一氧化碳(CO)之后被发现的另一种具有神经调节作用的新型气体信号分子〔7〕,H2S不仅在神经系统发挥重要的生理作用,而且还可作为一种内源性的抗氧化剂,在氧化应激时能够清除羟自由基等活性氧簇〔8,9〕,具有抗氧化、恢复认知功能、调节脑血流量等作用,也提示H2S可能也参与老年痴呆动物或病人神经元的保护〔10〕。本研究结果显示随着大脑I/R时间的延长,各组大鼠血清H2S含量均减少,而海马CA1区凋亡神经细胞数逐渐增加;随着血清H2S含量的降低,海马神经细胞凋亡率逐渐升高,两者间呈现明显的负相关关系,提示内源性H2S对脑I/R损伤中的神经细胞具有保护作用,可以减少细胞凋亡的发生。关于H2S发挥保护作用的机制尚不十分清楚,有研究表明,对于体外培养的心肌细胞,H2S可通过直接清除H2O2和O2而减少脂质过氧化产物MDA的生成〔11〕;对于神经细胞,H2S可抑制过氧亚硝酸盐介导的细胞毒性作用,抑制细胞内蛋白质分子的氧化和硝基化〔8〕,或者通过促进还原型谷胱甘肽的产生而对抗氧化应激损伤〔9〕,H2S被证实可激活ATP敏感的K通道(KATP)〔12〕,从而起到细胞保护作用。综上所述,I/R损伤可引起内源性H2S含量降低,从而导致海马神经细胞凋亡率升高;I/R损伤后大鼠学习记忆功能障碍是海马神经细胞凋亡的必然结果。因此,提供外源性H2S或H2S供体以降低海马神经细胞凋亡率可能是治疗VD的新方法。

【参考文献】
    1 李 梨,周岐新,石京山. 血管性痴呆研究概况〔J〕. 中国老年学杂志,2005;25(10):1269.

  2 Pulsinelli WA, Brierley JB. A new model of bilateral hemispheric ischemia in the unanesthetized rat〔J〕. Stroke, 1979;10(3):26772.

  3 高晓兰,宋焱峰,候一平,等.植物雌激素对血管性痴呆大鼠学习记忆及海马神经肽Y的干预效应〔J〕.中国临床康复,2006;10(6):52.

  4 Gross A, McDonnell JM, Korsmeyer SJ. Bcl2 family members and the mitochondria in apoptosis〔J〕. Genes Dev, 1999;13(15):1899911.

  5 田金洲. 血管性痴呆〔M〕. 北京:人民卫生出版社,2003:271.

  6 刘亚君,崔 鹤,谢东萍,等. Bcl2和Bax在缺血预处理保护海马神经元缺血再灌注损伤中的作用〔J〕. 山东大学学报(医学版),2006;44(3):230.

  7 Baranano DE, Ferris CD, Snyder SH. Atypical neural messengers〔J〕. Trend Neurosci, 2001;24(2):99106.

  8 Whiteman M, Armstrong JS, Chu SH,et al.The novel neuromodulator hydrogen sulfide:an endogenous peroxynitrite scavenger〔J〕. Neurochemistry, 2004;90(3):7658.

  9 Kimura Y, Kimura H. Hydrogen sulfide protects neurons from oxidative stress〔J〕. FASEBJ, 2004;18(10):11657.

  10 Legator MS, Singleton CR, Morris DL,et al.Health effects from chronic lowlevel exposure to hydrogen sulfide〔J〕. Arch Environ Health, 2001;56(2):12331.

  11 Geng B, Chang L, Pan C,et al. Endogenous hydrogen sulfide regulation of myocardial injury induced by isoproterenol〔J〕. Biochem Biophys Res Commun, 2004;318(3):75673.

  12 Zhao W, Zhang J, Lu Y,et al.The vasorelaxant effect of H2S as a novel endogenous gaseous KATP channel opener〔J〕. EMBO, 2001;20(21):600816.


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